Мутации в гене CYP21A2, кодирующем фермент 21-гидроксилаза, являются причиной развития одного из наиболее распространенных наследственных заболеваний: врожденной дисфункции коры надпочечников (ВДКН). Более 90% случаев этого заболевания связано с нарушениями функционирования данного фермента.

Заказчиком наборов для выявления мутаций в гене CYP21A2 выступила самарская компания «Ген-технология», апробация тест-систем проходила на базе ГБУЗ «Самарский областной центр планирования семьи и репродукции». После успешного завершения клинических испытаний, компания «Ген-технология» приступила к использованию новых наборов в диагностических целях.

Врожденная недостаточность фермента 21-гидроксилазы, как правило, негативно влияет на репродуктивную функцию, поэтому подобные тесты наиболее востребованы в медучреждениях, специализирующихся на проблемах бесплодия.

Виталий Ведерников, руководитель группы ПЦР инфекционных заболеваний лаборатории молекулярной диагностики ГК Алкор Био:

«Нами разработано пять наборов для определения следующих мутаций в гене 21-гидроксилазы: CYP21A2*8, CYP21A2*9, CYP21A2*10, CYP21A2*17, CYP21A2*19. Помимо этого мы разработали еще два набора, необходимых на предварительных этапах анализа — набор для количественной оценки ДНК человека и набор для предамплификации гена CYP21A2 в присутствии псевдогена. Выявление полиморфизмов в гене 21-гидроксилазы включает пять этапов: экстракция ДНК из клинического материала; оценка концентрации ДНК; разведение ДНК до рабочей концентрации; предамплификация гена CYP21A2 с последующим разведением продуктов ПЦР в 1000 раз; проведение дуплексного анализа для определения полиморфизмов в гене CYP21A2.

На первом этапе экстракция ДНК может быть проведена с использованием большинства наборов соответствующего назначения. Для корректной предамплификации гена CYP21A2 на четвертом этапе требуется количественная оценка ДНК с последующим ее разведением до рабочих концентраций (второй и третий этап, соответственно). Однако, второй и третий этапы могут быть исключены в случае использования для экстракции ДНК из цельной крови набора «Экстра-ДНК-Био» производства ГК Алкор Био за счет получения на выходе ДНК с концентрацией, подходящей для реакции предамплификации.

На четвертом этапе проводится предамплификация гена 21-гидроксилазы, это необходимо в связи с тем, что в геноме человека, помимо гена CYP21A2, также присутствует его псевдоген на 95% совпадающий с ним по последовательности. Если не проводить специфическую предамплификацию, то могут появиться ложно-положительные результаты связанные с обнаружением полиморфизмов встречающихся в псевдогене, но при этом не вызывающих развитие патологии. Соответственно, нами был разработан набор, позволяющий специфически амплифицировать только ген CYP21A2 в присутствии псевдогена с учетом даже рекомбинантных форм.

На пятом этапе анализа — определении мутаций, в качестве ДНК-матрицы используются ампликоны, полученные в результате предамплификации гена. Для анализа полиморфизмов, нами в наборах был использован подход на основе плавления дуплексов, позволяющий с высокой надежностью определять искомые мутации. В дальнейшем планируется расширить перечень определяемых полиморфизмов в гене CYP21A2».

При создании новых наборов разработчики ГК Алкор Био использовали реагенты собственного производства: Taq M полимеразу, зонды, праймеры.

О разработке и производстве тест-систем на основе ПЦР (полимеразной цепной реакции) для сторонних организаций ГК Алкор Био объявила в начале 2015 года. ПЦР тест-системы широко применяются для выявления и количественного анализа микроорганизмов, для определения генетических полиморфизмов (изменений в структуре генома) и других исследований. В такой услуге в первую очередь могут быть заинтересованы медико-генетические центры, диагностические лаборатории и научно-исследовательские институты.

Справка

Частота встречаемости классической формы ВДКН в мире составляет в среднем 1:15000–16000 новорожденных, в России — 1:8662.

Адреногенитальный синдром, врожденная дисфункция коры надпочечников — группа наследственных заболеваний человека с аутосомно-рецессивным характером наследования, обусловленных нарушением биосинтеза стероидных гормонов в коре надпочечников. Врожденным дефицитом стероид 21-гидроксилазы вызвано 90–95% всех случаев адреногенитального синдрома.

Анализ гена CYP21A2 на наличие мутаций крайне важен для прогнозирования тяжести заболевания в ходе пренатальной диагностики и своевременной пренатальной или ранней постнатальной терапии. Вовремя начатая пренатальная терапия помогает предупредить осложнения, связанные с нарушением стероидогенеза in utero, такие как повреждения репродуктивной функции, низкорослость, трансформация пола, а также водно-электролитный дисбаланс в случае наиболее тяжелой сольтеряющей формы заболевания.

Источник